Die vom König an Posa in Auftrag gegebene Untersuchung der Beziehung zwischen Karlos und der Königin Elisabeth findet im vierten Akt von „Don Karlos“ statt.

Hierbei entdeckt die Königin vor allem zunächst den Aufbruch ihrer Schatulle und die gestohlenen Briefe und bespricht sich darüber mit dem Marquis von Posa. Beide sind sich schnell einig: Karlos muss nach Flandern gehen. Graf von Lerma geht indessen zu Don Karlos und warnt diesen vor seinem eigenen Freund, da dieser jetzt plötzlich ein enger Vertrauter des Königs sei. Angetrieben von dieser Warnung macht sich Karlos verstärkt Gedanken über die Machenschaften Posas. Das komische Verhalten Posas hält ihn jedoch noch nicht davon ab, ihm die Brieftasche auszuhändigen, in der sich auch ein Brief Elisabeths befindet.

In einem Monolog verdeutlicht der Marquis von Posa, warum er sich so verhält und rechtfertigt vor allem seine Verschwiegenheit gegenüber seinem Freund Karlos. Zwischenzeitlich ist das Vertrauen gegenüber der Königin beim König soweit abgesunken, dass er glaubt, dass die Infantin nicht sein eigenes Kind sei. Bei einem Zusammentreffen von Königin und König fordert die Königin eine Strafe für das Aufbrechen ihrer Schatulle. Der König fordert von ihr eine Aufklärung über ihre Beziehung zu Karlos. Da Philipp aus sich herausgeht und maßlos wird, bricht Elisabeth am Ende zusammen. Der Marquis von Posa wird diesbezüglich schnell herbeigerufen. Der Graf von Lerma tätigt eine weitere Warnung gegenüber Karlos, während Alba und Domingo bereits versuchen gegen Posa bei der Königin zu intrigieren. Im Rahmen dieser hochkomplizierten und verwirrenden angelegten Intrige ist es am Ende klar, dass Posa nicht sein Ziel erreicht. Auch sein politisches Ziel ist bisher noch nicht reif genug für diese Zeit und scheitert. Dies beflügelt auch, dass der Herzog von Alba wieder an seine Macht kommt und letztlich als Statthalter nach Flandern geht.